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干货│T4 RNA Ligase 1:RNA研究的多功能粘合剂

作者:翌圣生物科技(上海)股份有限公司 2024-05-15T00:00 (访问量:36536)

 

近年来,RNA研究在生物医学领域引起了广泛关注,并取得了突破性进展。非编码RNA在基因表达调控中发挥着关键作用,它们通过与DNA或蛋白质相互作用,影响基因的转录、剪接和稳定性,从而调控细胞的功能和命运。此外,RNA编辑也成为研究的热点,通过改变mRNA分子中的核苷酸,我们可以改变蛋白质的序列和功能。这些进展为我们深入理解基因调控、疾病机制以及开发治疗手段提供了重要的基础。

 

RNA研究的进展,离不开工具酶的发现和改造。今天,我们要向大家介绍一种在RNA研究中至关重要的工具酶——T4 RNA Ligase 1。

 

 

 

T4 RNA Ligase 1简介

 

T4 RNA Ligase 1是一种ATP依赖性的酶,能催化单链RNA、单链DNA或单核苷酸之间形成磷酸二酯键的连接反应。它对于RNA分子间的连接尤为高效,其次便是DNA与RNA之间的连接,而在连接DNA分子时效率相对较低。因此,T4 RNA Ligase 1也被称为“单链RNA连接酶”。在应用方面,T4 RNA Ligase 1广泛应用于多个分子生物学领域,包括microRNA (miRNA)检测、RNA文库构建、环状重测序(CirSeq)、向导RNA(gRNA)和环状RNA(circRNA)合成等实验中。

 

 

 

T4 RNA Ligase 1应用

 01

miRNA检测

miRNA检测在深入理解基因调控机制、发现疾病相关标志物、指导早期诊断、预后评估和制定治疗策略等方面具有关键作用。然而,由于miRNA的长度一般只有20-30 nt,与标准PCR引物长度相近,这给检测带来了一定的困难。

 

为了解决这个问题,科学家们巧妙地利用T4 RNA Ligase 1将miRNA首尾相连成为circRNA,并结合RT-qPCR技术,研发出了一种名为miR-ID的新型检测方法。miR-ID技术有效地解决了传统RT-qPCR方法在miRNA检测时复杂的茎环逆转录引物设计问题,同时,其滚环逆转录过程能够生成含有大量重复目标序列的cDNA,这使得miRNA和其他小RNA分子的检测变得极为灵敏。这一创新为miRNA检测提供了一种更为可靠和有效的工具,进一步推动了miRNA研究和临床应用的发展。

 

miR-ID包括以下步骤:

 01 

miRNA的环化

使用T4 RNA ligase 1使miRNA分子内的5’磷酸基团与3‘羟基首尾相连成为circRNA;

02 

circRNA的逆转录

通过逆转录酶将circRNA转换为包含大量miRNA重复序列的多聚cDNA;

03 

qPCR扩增

使用5'端重叠引物和非特异性染料(如SYBR Green)对多聚cDNA片段进行PCR扩增。当miRNA存在时,RT-qPCR结果为阳性,当miRNA不存在时,RT-qPCR结果为阴性。

 

02

RNA文库构建

构建RNA测序文库是一个复杂的多步骤过程,涉及RNA的富集、片段化、逆转录成cDNA、接头连接以及PCR扩增等关键步骤。传统方法中,这一流程不仅繁琐,还要求进行三次样品纯化,增加了实验的时间和成本。此外,使用随机引物进行cDNA合成可能会引入偏差,导致反转录效率不均一,从而影响测序结果的准确性。

 

T4 RNA Ligase 1的引入为简化建库流程带来了突破。它允许直接在断裂的RNA分子上连接接头,绕过了随机引物的使用,从而避免了由反转录不平衡引起的扩增偏差。通过采用T4 RNA Ligase 1,测序文库构建的质量得以提升,而且纯化步骤从三步缩减至两步,显著节约了纯化试剂和时间,并减少了实验操作的复杂性与劳动成本,使得整个建库流程更为高效和经济。

 

03

CirSeq

在解读NGS数据时,如何准确区分真正的基因变异和测序错误是一个具有挑战性的问题。这些错误可能源自两个主要方面:NGS测序过程中的误差以及文库制备阶段的错误。CirSeq是一种高效且高精度的RNA病毒群体二代测序技术。它利用T4 RNA Ligase 1将病毒RNA片段环化并转化为串联重复的cDNA序列。在测序过程中,对每个读段中的冗余拷贝进行比对,从而得到与初始RNA模板一致的序列。这种方法产生的测序数据错误率远低于RNA病毒变异频率,有助于超罕见变异的检出和低频变异的准确测量。

 

04

gRNA合成

CRISPR/Cas系统,一种广泛使用的基因组编辑技术,它由Cas蛋白和人工重组的gRNA组成。这种系统能够精确指导Cas蛋白对目标基因进行敲除、插入和突变修饰。目前,我们主要采用体外转录和化学合成的方法来制备gRNA。化学合成法凭借其编辑效率高、细胞毒性低以及稳定性好等优点,在实际应用中得到了广泛的认可。然而,这种方法也存在一些局限性,如合成长度的限制以及副产物难以完全去除等问题。为了克服这些困难,研究者们已经尝试使用RNA连接酶将多个合成的RNA连接在一起,通过这种方式,提高gRNA的纯度、产量和完整性,从而有效提高编辑效率并减少非特异性编辑的发生。

 

05

circRNA合成

线性RNA在生物学研究和治疗中具有广泛的应用,然而其较短的半衰期限制了其在长期蛋白质翻译方面的应用。与此不同,circRNA是一种闭合环状结构的RNA,广泛存在于各种生物体中,具有更高的稳定性和非帽依赖蛋白质翻译的特点。因此,circRNA疫苗被认为是新一代RNA疫苗及药物的潜在选择,具备更简单、稳定性更好和持久性更长的优势。目前,合成circRNA的方法主要包括酶促连接合成和化学合成两种。其中,酶促连接合成通过体外转录反应实现,利用DNA模板、T7 RNA聚合酶和RNA连接酶(如T4 RNA Ligase 1)等进行。酶促连接合成能够以较低成本实现更长的circRNA合成,因此在目前被广泛应用。

 

T4 RNA Ligase 1作为一种多功能酶,在RNA研究中发挥着至关重要的作用,其应用不仅限于上述领域。翌圣生物专注于RNA研究领域,提供与RNA研究相关的工具酶原料,为RNA研究技术的应用和发展提供支持。

 

 

 

产品推荐

 

产品定位

产品名称

货号

RNA环化

T4 RNA Ligase 1

14651ES

RNA纯化

RNase R (20 U/μL)

14606ES

质粒线性化

BspQI GMP-grade(10 U/μL)

10664ES

Bsa I GMP-grade

10661ES

模板去除

DNase I GMP-grade

10611ES

体外转录

T7 RNA Polymerase GMP-grade (50 U/μL)

10624ES

Pyrophosphatase,Inorganic GMP-grade

10620ES

Murine RNase inhibitor GMP-grade

10621ES

mRNA Vaccinia Capping Enzyme GMP-grade

10614ES

mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase GMP-grade

10612ES

 

参考文献:

[1] Kumar P, Johnston B H, Kazakov S A. miR-ID: a novel, circularization-based platform for detection of microRNAs[J]. Rna, 2011, 17(2): 365-380.

[2] Fuchs R T, Sun Z, Zhuang F, et al. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure[J]. PloS one, 2015, 10(5): e0126049.

[3] Acevedo A, Andino R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nat Protoc. 2014;9(7):1760-1769. doi:10.1038/nprot.2014.118.

 

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