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1区,IF=16.8| 云序RNA乙酰化测序/acRIP-seq助力心梗机制研究!

作者:上海云序生物科技有限公司 2022-04-15T11:37 (访问量:9532)

N4-乙酰胞苷(ac4C)是RNA修饰的一种,被发现是由N-乙酰转移酶10(NAT10)催化的一种新的mRNA修饰,可增加mRNA稳定性并提高其翻译效率。近期,云序客户青岛大学王昆教授课题组在Advanced Science杂志(IF=16.8)上发表了文章PIWI-Interacting RNA HAAPIR Regulates Cardiomyocyte Death After Myocardial Infarction by Promoting NAT10-Mediated ac4C Acetylation of Tfec mRNA,发现了piRNA HAAPIR通过促进nat10介导的mRNA ac4c乙酰化来调节心肌梗死后的心肌细胞死亡。云序生物提供了其中RNA乙酰化测序/acRIP-seqRNA-seqChIP-seq服务。下面我们为大家介绍这篇文章的研究思路。

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发表期刊:Advanced Science
影响因子:16.806
发表时间:2022年2月9日
研究方法RNA乙酰化测序/acRIP-seqRNA-seqacRIP-qPCRChIP-seq
文章链接PIWI-Interacting RNA HAAPIR Regulates Cardiomyocyte Death After Myocardial Infarction by Promoting NAT10-Mediated ac4C Acetylation of Tfec mRNA

技术路线


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研 究 内 容


 1、心脏缺血/再灌注相关piRNA(s)的鉴定和特征
为了研究piRNAs与心肌细胞凋亡相关的功能,作者选择了两组:sham组与缺血/再灌注(IR)组小鼠心脏进行比较分析。与sham组相比,IR组存在19个piRNAs增加,5个piRNAs减少。
并检测了过氧化氢处理后,这些piRNAs在心肌细胞中的表达水平。其中,piRNA DQ542443表达水平显著升高。这是一个在心肌中高表达的piRNA。因此,作者推测DQ542443在IR诱导的心脏损伤中具有潜在的调控作用,并选择其进行进一步研究,并将其命名为HAAPIR,并证实HAAPIR在3‘端上包含2’-O-甲基化。荧光原位杂交(FISH)检测结果显示,HAAPIR同时分布于心肌细胞的细胞核和细胞质中。
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2 、抑制HAAPIR可阻断H2O2诱导的心肌细胞凋亡

为了证实HAAPIR在调节心肌细胞凋亡中的作用,作者构建了体外H2O2诱导的细胞凋亡模型,发现用抑制剂敲除HAAPIR后,减弱了H2O2诱导的HAAPIR表达增加。HAAPIR敲低抑制了H2O2诱导的心肌细胞凋亡的增加。同时,作者还验证了HAAPIR是否参与了心肌细胞线粒体裂变的调控,发现HAAPIR的下调抑制了H2O2诱导的线粒体碎片化的增加,HAAPIR的过表达会导致心肌细胞凋亡和线粒体碎片化。
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3、HAAPIR缺失可改善I/R诱导的细胞凋亡和心肌损伤
为了研究HAAPIR是否与心肌损伤相关及其在体内的功能作用,作者使用CRISPR/Cas9技术构建了HAAPIR敲除(HAAPIRKO)小鼠。通过测序和qPCR进行基因表达分析,证实了KO小鼠中HAAPIR的缺失。HAAPIRKO小鼠心脏没有任何形态学或功能表型变化。与野生型相比,HAAPIRKO小鼠心脏的心肌细胞凋亡和线粒体碎片化显著减少。此外,与I/R损伤的心脏相比,HAAPIRKO心脏的梗死面积减小和心室功能改善。综上所述,HAAPIR缺失可阻断心肌细胞凋亡,减轻I/R损伤引起的心肌功能障碍。

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4、HAAPIR与NAT10结合,调节其ac4C乙酰化活性

接下来,作者试图研究HAAPIR调控心肌细胞凋亡的分子机制。作者进行了RNA pull down实验,发现HAAPIR在心肌细胞中与NAT10结合,并通过RIP和qPCR验证两者在体内有直接相互作用。此外,HAAPIR的过表达或敲除并不影响心肌细胞中NAT10 mRNA和蛋白的表达水平。综上所述,HAAPIR与NAT10相互作用,可能与ac4C乙酰化活性的调控有关。

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5、HAAPIR基因敲除小鼠心脏中的ac4c乙酰化
为了阐明HAAPIR调控n4-乙酰胞苷修饰的分子机制,作者在HAAPIRKO和WT小鼠心脏中进行了RNA乙酰化测序(acRIP-seq)。测序结果显示,HAAPIRKO和WT小鼠心脏共有2139个共同的ac4C峰,占HAAPIRKO心脏总乙酰化峰的63.02%,在WT心脏中占51.62%。Ac4C多发生在mRNA中,大多数mRNA包含一个或两个ac4C峰。对ac4C峰的序列分析显示,U(A)UCCAGG和CAGCA(U)G(C)基序在ac4C位点内高度富集。Ac4C峰主要分布在编码序列(CDSs)、近终止密码子和3‘非翻译区(3’UTRs)。GO分析显示,ac4c修饰上调的基因主要参与心血管系统发育、正向调控信号转导和细胞死亡;ac4C修饰下调的基因主要参与分子功能调控、细胞分化调控和细胞死亡。这些结果表明,具有ac4C修饰的基因与细胞功能或在心脏中的基因表达的调控。为了确定ac4C修饰与基因表达之间的关系,作者同时在HAAPIRKO和WT小鼠的心脏中进行了RNA-seq,将基因表达水平与ac4C修饰水平相关联,筛选靶基因。
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6、HAAPIR促进NAT10介导的ac4C修饰和Tfec mRNA的表达
接下来,作者对一些被报道的与细胞凋亡相关的差异乙酰化基因和差异表达基因进行了acRIP-qPCR和qPCR检测。其中,TFEC的ac4C修饰最低,在HAAPIRKO心脏中表达显著降低。相比之下,在过表达HAAPIR的心肌细胞中,Tfec中ac4C的富集增加,Tfec mRNA和蛋白水平增加。基于以上结果,作者选择Tfec作为ac4C调控心肌细胞凋亡的候选靶点,进一步研究。
然后作者研究了HAAPIR如何上调Tfec的表达。在HAAPIRKO心脏中,NAT10与Tfec mRNA的结合显著降低。此外,NAT10在心肌细胞中的强制表达增加了Tfec mRNA中的ac4C修饰,提高了Tfec蛋白水平,而这些作用在HAAPIR过表达时得到增强。这些结果表明,HAAPIR通过NAT10介导了Tfec mRNA中的ac4C修饰,而这种乙酰化修饰增强了其稳定性和翻译能力。
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7、抑制Tfec可减轻体内外心肌细胞的凋亡
在心肌细胞中,Tfec的表达在过氧化氢刺激下有所增加,而Tfec的沉默阻断了H2O2诱导的心肌细胞凋亡和线粒体碎片化。在体内,心肌I/R损伤后Tfec mRNA和蛋白水平升高,Tfec下调显著降低了Tfec水平、心肌细胞凋亡和梗死面积。此外,Tfec的敲除抑制了H/R诱导的细胞凋亡,而不影响心肌细胞的坏死。此外,HAAPIR的下调减弱了H2O2诱导的Tfec表达的增加和细胞凋亡,而这些作用在NAT10过表达时减弱。结果表明,Tfec参与了心肌细胞凋亡的调控,而Tfec是HAAPIR和NAT10的直接下游分子。
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8、Tfec在心肌细胞凋亡过程中调控Bik的表达
为了探索Tfec的下游信号通路,作者进行了ChIP-seq,鉴定了数千个不同的TFEC结合染色质区域,使用这些TFEC结合区域发现的基序产生了一致的TFEC基序(CACGTG)。作者同时进行了RNA-seq,发现,过氧化氢处理的TFEC过表达心肌细胞中有694个上调差异表达和959个下调差异表达mRNA。在差异表达数据集中,与TFEC结合染色质区域和TFEC下游相关基因的交集包含376个基因。综合与TFEC结合启动子区域相关的基因和具有凋亡调控功能的基因筛选出了Bik——一种促凋亡蛋白。作者通过ChIP-qPCR验证了TFEC与所鉴定的序列的结合,并证实了在TFEC过表达后,Bik启动子区域比正常的IgG显著富集。过表达Tfec显著增加了H202诱导的Bik mRNA的表达,而敲除TFEC则降低了H202刺激的Bik表达的增加,表明转录因子TFEC刺激了Bik的表达。体内实验验证了这些结论。在心肌细胞中,HAAPIR增加了Bik蛋白水平和凋亡,而这些增加在TFEC敲低或NAT10敲低后被逆转。
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总  结
该研究发现了一种心脏凋亡相关piRNA(HAAPIR),通过靶向N-乙酰转移酶10(NAT10)介导的N4-乙酰胞苷(ac4C)转录因子EC(Tfec)mRNA转录物来调节心肌细胞凋亡。作者验证了与野生型小鼠相比,HAAPIR缺失可减轻缺血/再灌注诱导的心肌梗死,改善心功能。在机制上,通过RNA pull downRIP实验发现了HAAPIR直接与NAT10相互作用;通过RNA乙酰化测序/acRIP-seq结合RNA-seq筛选出受HAAPIR影响其乙酰化修饰和表达的靶基因TfecmRNA;通过细胞实验及ChIP-seq验证了TFEC可以进一步上调促凋亡因子Bik的积累,调控心肌细胞凋亡的进展。HAAPIR-NAT10-TFEC-BIK信号轴可能是减少缺血性心脏病中心肌细胞凋亡引起的心肌损伤的潜在靶点。

云序生物ac4C修饰研究五大模块

01 ac4C RNA修饰测序
ac4C RNA修饰测序
对ac4C RNA乙酰化,目前最流行的检测手段为acRIP-seq技术,适用于ac4C RNA乙酰化谱研究,快速筛选ac4C RNA乙酰化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的ac4C测序:
  • ac4C 全转录组测序(涵盖mRNA,LncRNA,circRNA)
  • ac4C  LncRNA测序(涵盖LncRNA和mRNA)
  • ac4C  Pri-miRNA测序(涵盖Pri-miRNA和mRNA)
  • ac4C  mRNA测序
  • ac4C  rRNA测序
  • ac4C  circRNA测序
  • ac4C  tRNA测序
02 检测整体ac4C RNA修饰水平
LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平
精准高效,可以实现一次检测,9类修饰水平检测,一步到位。
03 ac4C RNA修饰上游酶的筛选
ac4C RNA修饰相关酶PCR芯片
寻找上游直接调控ac4C RNA乙酰化的甲基转移酶。
04 ac4C RNA修饰靶基因验证
acRIP-qPCR
云序提供acRIP-qPCR服务,可针对mRNA,lncRNA,环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测,低通量验证靶基因RNA修饰水平。
05 机制互作研究
RIP-seq/qPCR
筛选或验证RNA修饰直接靶点,研究RNA修饰靶基因的调控机制。
RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白,研究相应的分子调控机制。
双荧光素酶实验
验证两基因互作,研究相应的分子调控机制。
ChIP-seq
筛选或验证目标蛋白与DNA互作,研究相应的分子调控机制。

--  云序生物服务优势  --
优势一:发表10分以上文章最多的RNA修饰测序服务平台。云序已累计支持客户发表71+篇高水平RNA修饰文章,合计影响因子570+,是国内支持发文最多、累计影响因子最高的公司。
优势二:至今完成4000+例RNA修饰高通量测序样本,全面覆盖医口、农口等各类样本。
优势三:全面检测mRNA和各类非编码RNA(circRNA,lncRNA,Pri-miRNA等)。
优势四:独家提供ac4C一站式服务:ac4C整体水平检测acRIP-seqacRIP-qPCR验证、RIPRNA pull down等。

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